Voltaire
MICROBIOLOGIA PREDICTIVA
La microbiología predictiva describe las distintas respuestas microbianas de los alimentos a los diferentes ambientes. El control microbiológico de los alimentos y de los factores que influyen en su deterioro en cualquier punto de la cadena alimentaria cuenta con la microbiología predictiva. Esta disciplina, conocida en algunos sectores también con el nombre de ecología microbiana de los alimentos, describe las distintas respuestas microbianas de los alimentos a distintos ambientes a partir de modelos matemáticos y otros métodos numéricos y estadísticos. Los factores que influyen en la contaminación de alimentos son varios. Por un lado, interviene la temperatura, el pH o la actividad de agua. La mayoría de patógenos no crecen por debajo de ciertas temperaturas y su modo de actuar es distinto también en función del nivel de pH del alimento (ácidos o alcalinos) y de su estructura (mayor o menor concentración de agua). Con la microbiología predictiva se establece un sistema de control microbiológico que puede utilizarse en cualquier punto de la cadena de producción, desde la granja a la mesa. Uno de los principales objetivos de este sistema es predecir qué puede suceder durante el almacenamiento o el procesado de alimentos.
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Debe tenerse en cuenta que determinar la causa de contaminación bacteriana en una etapa particular es una tarea compleja ya que antes deben conocerse los motivos que hace que una bacteria crezca en unas determinadas condiciones y no en otras. La Microbiología Predictiva surge como área emergente de la Microbiología de alimentos, como alternativa frente a la necesidad de acortar tiempos de respuestas, reducir costos económicos, reemplazar metodologías dispendiosas y disminuir la laboriosidad en los análisis de la Microbiología clásica. Es multidisciplinaria ya que se fundamenta en las distintas teorías Matemáticas, Microbiología, Estadística, Informática, Bioquímica, etc., con el fin de desarrollar, validar y aplicar modelos matemáticos que permitan estimar las respuestas de los microorganismos ante los cambios en diversos factores que les afecta. La microbiología predictiva se basa en la premisa que las respuestas de los microorganismos ante los cambios en los factores ambientales pueden ser reproducidas de forma controlada en laboratorio, de esta forma, a través de diversos modelos matemáticos es posible predecir cual será el comportamiento de estos microorganismos cuando cambian las condiciones que les rodea.
La microbiología predictiva dio sus primeros pasos a principios de los años 90 y desde entonces ha ido evolucionando para evaluar cuantitativamente cuál es el comportamiento (crecimiento, supervivencia o inactivación) de microorganismos en los alimentos en los diferentes momentos del proceso, envasado y distribución, lo que ayuda a optimizar dichos procesos, desarrollar tratamientos de inactivación, nuevas formulaciones de productos y condiciones de conservación y envasado más seguras. Hoy día es una disciplina científica establecida y reconocida. Para generar un modelo predictivo es necesario obtener un conjunto de datos experimentales que serán utilizados para obtener un modelo matemático que relaciona los parámetros respuesta del microorganismo como, por ejemplo, la velocidad de crecimiento, con los factores encontrados en los alimentos (pH, Aw, Temperatura, etc). Una de las áreas de la microbiología de alimentos que más interés ha suscitado en las últimas décadas ha sido la microbiología predictiva, ya que permite anticipar el efecto del cambio en determinados factores medioambientales sobre el crecimiento o inactivación de los microorganismos.
La microbiología predictiva se sustenta en el desarrollo de modelos matemáticos o probabilísticos de segunda generación y su introducción en la industria requiere el desarrollo de software de fácil uso o lo que se denomina modelos de tercera generación. En los últimos años, ha habido un gran desarrollo de la modelización matemática y de la microbiología predictiva, ya que son herramientas valiosas en la planificación de programas de análisis de peligros y control de puntos críticos y toma de decisiones, proporcionando la primera estimación del cambio esperado en la población microbiana cuando se exponen a un grupo específico de condiciones. La microbiología predictiva es un campo de estudio que combina elementos de microbiología, matemáticas y estadística para desarrollar modelos que describan y predigan matemáticamente el crecimiento o muerte de los microorganismos, cuando se les somete a condiciones medioambientales específicas. La microbiología predictiva está basada en la premisa de que las respuestas de poblaciones de microorganismos a factores medioambientales son reproducibles y que por lo tanto es posible, interpolando entre puntos, predecir el comportamiento de esos microorganismos para condiciones que no han sido ensayadas. Las condiciones medioambientales incluyen tanto a factores intrínsecos (pH, Aw , concentración de NaCl), como los extrínsecos (temperatura o composición gaseosa).
El diagnóstico microbiológico está basado en técnicas de laboratorio que requieren un tiempo asociado al crecimiento de los microorganismos, el cual tiene un impacto desfavorable en la toma de decisiones, especialmente en la industria. El tiempo requerido para la revitalización de las células y su recuento a través de las Unidades Formadoras de Colonias (UFC), es de al menos 48 horas. Además, para la identificación de patógenos es común recurrir a pruebas bioquímicas o de medios selectivos, lo cual conduce a esperar días o incluso semanas para obtener resultados. Por tal motivo se han desarrollado métodos rápidos para obtener resultados en menor tiempo, entre los cuales están los propuestos por la Microbiología Predictiva. Puede ser utilizada para modelar el crecimiento, sobrevivencia o muerte de los microorganismos en función de los principales factores de conservación de alimentos, especialmente cuando estos factores son utilizados de manera conjunta en los llamados métodos combinados de conservación. En otras referencias, se sitúa el inicio del uso de la Microbiología Predictiva en la década de 1930, cuando Scott estableció que el conocimiento de la velocidad de crecimiento de ciertos microorganismos a diferentes temperaturas era de vital importancia para los estudios sobre el deterioro de la carne fresca.
Una vez obtenidos estos datos, se podía predecir la influencia relativa ejercida por vanos organismos en el deterioro a cada temperatura de almacenamiento. Scott entendió claramente el uso potencial de la acumulación de datos cinéticos sobre la respuesta de los microorganismos, para predecir la vida útil y la seguridad de los alimentos. Después de mucho tiempo de silencio de la Microbiología Predictiva en la literatura científica, en las décadas de 1960 y 1970 los modelos predictivos fueron empleados para resolver problemas de intoxicación alimentaria, en particular botulismo. Sin embargo, fue hasta la década de 1980 cuando empezó el interés por la Microbiología Predictiva como resultado de un masivo brote de toxiinfecciones alimentarias y, por consiguiente, la conciencia pública de la necesidad de suministrar alimentos sanos y seguros. Dos microorganismos patógenos transmitidos por los alimentos, uno tradicional como es el caso de Salmonella y otro tipo emergente, Listeria monocytogenes de origen psicótropo, favorecieron a situar a las investigaciones alimentarias como una prioridad para los gobiernos de los Estados Unidos, Reino Unido, Australia y Nueva Zelanda.
La microbiología predictiva es una herramienta que permite conocer el comportamiento de los microorganismos en todo un rango de condiciones y combinaciones ambientales distintas. Se basa en la aplicación de modelos matemáticos para predecir el comportamiento de los microorganismos en un alimento, según variables ambientales reproductibles, como el grado de acidez, humedad, atmósfera, temperatura, cuyos efectos sinérgicos influyen entre sí para ejercer un mayor o menor grado de protección frente a la alteración microbiana. Una de las principales ventajas de la aplicación de modelos predictivos es la versatilidad y flexibilidad que proporcionan, siendo una herramienta de gran utilidad para fabricantes de alimentos a la hora de:
•Asegurar la calidad y seguridad alimentaria
•Tomar decisiones sobre el diseño y la composición de nuevos productos (nuevas formulaciones de alimentos)
•Estimar la vida útil de los alimentos, en coherencia con la legislación aplicable y, por lo tanto, poder predecir y actuar sobre el deterioro de los alimentos. Los modelos predictivos microbiológicos son la base que se utiliza en los análisis cuantitativos de riesgos.
Pasos para la obtención de un modelo predictivo de crecimiento
1. Elección de microbiota de interés: En una primera fase se deben de obtener cultivos de los microorganismos o bien sus formas de resistencia (esporas) objetivo del estudio, seleccionando los serotipos o cepas microbianas de mayor importancia, aislados autóctonos, etc.
2. Determinación del rango experimental: Para la realización de modelos es necesario establecer las condiciones experimentales que definen el alcance del modelo, o rango de predicción, es decir, definir que parámetros (T; pH, Aw, Concentración de conservantes; atmósfera) y en qué magnitud serán estudiados.
3. Diseño experimental: Una vez definidos los parámetros, es necesario definir las combinaciones de factores que serán experimentalmente estudiadas y que proporcionarán robustez estadística para la obtención de los modelos.
4. Elección del modelo primario: El modelo primario define el comportamiento del microorganismo en las condiciones a los que está sometido y permite extraer parámetros de crecimiento, inactivación, producción de toxina, alteración... del microorganismo que se utilizan para definir el modelo.
5. Obtención de datos experimentales: En esta etapa se generarán datos primarios que proporcionan la base de los modelos. Es necesario obtener datos de cada una de las condiciones a estudiar y que proporcionen una respuesta definida por parte del microorganismo ante ellas.
6. Obtención del modelo secundario: Los parámetros obtenidos a partir de la modelización de datos experimentales en los modelos primarios, utilizan para obtener un modelo secundario que define el efecto de los parámetros estudiados sobre la evolución del microorganismo y por tanto su respuesta a las condiciones estudiadas.
7. Obtención del modelo terciario: Por último, se obtienen modelos terciarios que sirven de interfase entre los parámetros que definen el modelo y parámetros respuesta del microorganismo, como puede ser el tiempo necesario para llegar a una determinada concentración en el alimento; producción de toxina; rango que permite asegurar estabilidad etc.
La industria alimentaria está creando continuamente nuevos “hábitats” para los microorganismos mediante el diseño y reformulación de alimentos, atendiendo a la demanda de productos más frescos, naturales y sin conservantes artificiales. La obtención de estos nuevos productos supone en muchos casos un reto para las empresas que deben satisfacer a consumidores cada vez más exigentes en cuanto a la calidad sensorial y funcionalidad de los alimentos, pero a su vez asegurando que el producto en su conjunto posee las suficientes condiciones barrera frente al desarrollo de microorganismos patógenos y alterantes. Conocer cómo afectan los cambios en la composición de los alimentos, en la seguridad de los mismos y en su estabilidad durante el almacenamiento es básico. Los modelos predictivos son una manera rápida y eficaz de evaluar el potencial de crecimiento de microorganismos. Los modelos predictivos en el campo de la microbiología en ordenadores permiten estimar la tasa de crecimiento microbiano y cómo se producirá el desarrollo de un microorganismo particular bajo condiciones específicas. Algunas de las herramientas desarrolladas son un software para predecir el deterioro e inocuidad de productos del mar (SSSP), un sistema capaz de predecir la vida útil y el crecimiento bacteriano de Listeria monocytogenes en estos productos, así como métodos para realizar una evaluación cuantitativa del riesgo (ECR), destinado a la evaluación de riesgos asociados con la contaminación microbiana de los alimentos.
En otros casos, los modelos se basan en datos generados en el laboratorio, donde se analizan medios de cultivo microbiológicos con distintos parámetros como el nivel de pH. Los modelos predictivos son una manera rápida y eficaz de evaluar el potencial de crecimiento de microorganismos en condiciones específicas. Para microorganismos como Salmonella o Clostridium botulinum, el tiempo de crecimiento es uno de los parámetros más importante. La interpretación de los perfiles de temperatura con programas informáticos basados en modelos predictivos aporta información sobre la vida útil y seguridad de los alimentos. Así, se trabaja en modelos basados en las siguientes predicciones:
Temperatura. La temperatura tiene una fuerte influencia en el crecimiento e inactivación de las bacterias. Temperaturas inferiores a los 5ºC detienen la replicación de patógenos microbianos y retardan el deterioro de los alimentos, mientras que temperaturas superiores a los 55ºC son letales para ciertos patógenos.
Nivel de pH. Los niveles altos de acidez inhiben el crecimiento bacteriano. Algunos acidulantes como el ácido láctico son capaces de inhibir Listeria monocytogenes.
Actividad de agua. La actividad de agua (aw) es la cantidad de agua libre en el alimento, es decir, el agua disponible para el crecimiento de microorganismos y para que se puedan llevar a cabo diferentes reacciones químicas. Tiene un valor que varía de 0 a 1; cuanto mayor es el valor, más alto es el riesgo de crecimiento de bacterias, levaduras y hongos.
También conocida como ecología microbiana cuantitativa, la microbiología predictiva es una disciplina científica que trata de describir la respuesta de los microorganismos en los alimentos en función de los factores ambientales (intrínsecos, extrínsecos y de procesado). Gracias a funciones y técnicas de cálculo ofrecidas por las matemáticas y la estadística, esta rama científica permite simular las condiciones del alimento examinado, cuantificando el comportamiento de los microorganismos en un producto a lo largo del tiempo a través de parámetros de crecimiento, supervivencia o inhibición. Asimismo, permite estudiar los procesos bioquímicos relacionados con la producción de metabolitos (toxinas, compuestos volátiles, etc.) ante situaciones de combinación de factores de conservación y en distintos niveles de aplicación. La preferencia de los consumidores hacia productos cada vez más “frescos” y más “naturales” (o menos procesados), ha propiciado que en los últimos años la industria agroalimentaria haya ido cobrando un interés creciente por esta área de investigación.
Siendo una disciplina científica con una clara aplicación práctica en el marco de la evaluación y gestión global de la seguridad alimentaria, la microbiología predictiva permite entender y predecir el comportamiento de los microorganismos durante todas las fases de la cadena alimentaria tales como el procesado, el almacenamiento, la distribución, etc. En ese sentido, el enfoque cuantitativo de la microbiología predictiva proporciona información objetiva y cuantitativa útil en la toma de decisiones para planificación del sistema de APPCC, diseño de nuevos procesos y reformulación de productos, planificación de experimentos, etc. Así pues, se reconoce la microbiología predictiva como una herramienta útil en el ámbito de la gestión de la seguridad de los alimentos, tanto por parte de los diferentes sectores alimentarios como para las autoridades reguladoras. Los modelos matemáticos constituyen simplificaciones de la realidad. La temperatura, el pH y la actividad del agua se consideran los parámetros que más afectan al comportamiento microbiano. Sin embargo, existen casos en los que hay que tener en cuenta también otros factores intrínsecos (aditivos conservadores como nitritos, ácidos orgánicos débiles y/o sus sales, etc.) pero también extrínsecos (por ejemplo, las atmósferas protectoras) y de procesado (las tecnologías de conservación como las altas presiones) para tener un cuadro completo de la realidad que se quiera reproducir.
Los modelos matemáticos considerados en el ámbito de la microbiología predictiva se pueden clasificar según distintos criterios, usos y finalidades. Existen modelos probabilísticos (que permiten estimar los límites de crecimiento / no crecimiento o producción/no producción de toxina), modelos cinéticos de crecimiento, de supervivencia o de inactivación (para determinar el número de microorganismos en función del tiempo). Tras ajustar la curva de crecimiento microbiana mediante funciones matemáticas (modelos primarios) y estudiar sus parámetros según cambios en las condiciones ambientales (modelos secundarios), es posible modelizar el comportamiento microbiano en función de la temperatura, el pH, la actividad del agua y otros factores, independientemente del alimento. Desde un punto de vista práctico, con el fin de transferir e impulsar el uso de los modelos predictivos por parte de las empresas, es importante que los modelos primarios y secundarios se integren en forma de paquetes informáticos interactivos y de fácil uso (a veces llamados modelos terciarios). Actualmente, son diversas las herramientas predictivas disponibles en la red (libre acceso), entre las que encontramos:
Pathogen Modeling Program (PMP), que contiene numerosos modelos de crecimiento e inactivación de diferentes patógenos.
ComBase, una base de datos internacional donde se recogen y actualizan constantemente datos sobre crecimiento microbiano en diferentes condiciones. Esta interfaz presenta un formato sistemático simplificado, que permite su posterior comparación con los modelos predictivos disponibles. Además, permite la realización de predicciones en condiciones dinámicas de temperatura, es decir en condición de fluctuación de la temperatura a lo largo del tiempo. Es una base de datos europea iniciada en 2003 que recoge información sobre las respuestas microbianas más probables ante diversas condiciones ambientales. Uno de los principales objetivos por los que fue creada esta herramienta ha sido facilitar las evaluaciones de riesgo y desarrollo de modelos que permitan calcular el comportamiento de microorganismos cuando reaccionan a condiciones ambientales. Los criterios que incluye esta base de datos son el tipo de organismo, el alimento, el pH, la temperatura, la actividad de agua y otras condiciones alimenticias específicas.
En 2011, un programa de software fue capaz de predecir la cantidad de Salmonella que podía contener la carne de cerdo antes de que llegara a las estanterías. Con el programa, los expertos del Departamento de Agricultura estadounidense (USDA) rastrearon la bacteria, y otras contaminaciones bacterianas, en la cadena alimentaria. ComBase, un proyecto del Centro de Excelencia en Modelos Microbianos e Informática del USDA-ARS (CEMMI) trabaja como un "laboratorio virtual" destinado a generar asociaciones para avanzar en el uso de modelos predictivos de microorganismos en alimentos.
Seafood Spoilage and Safe Predictor (SSSP), elaborado para predecir la vida útil y el crecimiento de los microorganismos específicos de deterioro, histamina y de L. monocytogenes en diferentes productos de la pesca, a temperatura constante o en condiciones de fluctuación de temperatura. El modelo predictivo para L. monocytogenes ha sido recientemente validado para otros alimentos, especialmente productos cárnicos.
Opti.form Listeria Control Model, pensado para estimar los niveles de lactato y diacetato necesarios en productos cárnicos para retardar y/o inhibir el crecimiento de L. monocytogenes.
Un aspecto fundamental en la microbiología predictiva, antes de poder utilizar los modelos como herramientas predictivas para la toma de decisiones, es su validación en términos de exactitud (error global) y sesgo (grado de subestimación o sobreestimación de las predicciones). Para ello se deben comparar las predicciones generadas por el modelo con observaciones reales análogas y dentro del dominio experimental ensayado (por ejemplo, utilizando los resultados de ensayos de inoculación o challenge), determinando de esa manera el comportamiento del modelo en condiciones reales. A menudo, los modelos de inactivación y crecimiento de los microorganismos son generados a partir de experimentos llevados a cabo “in vitro” (es decir, en caldos de cultivo) y sus estimaciones suelen sobreestimar la inactivación y el crecimiento microbiano. El amplio margen de error de seguridad puede no ser aceptable en términos de producción industrial, exigiendo la validación de los modelos predictivos antes de tomar cualquier decisión de producción. Además, la información obtenida a partir de los modelos matemáticos requiere la interpretación por parte de microbiólogos expertos y conocedores de los principios de la ecología microbiana.
Las perspectivas de futuro para esta disciplina sugieren que las técnicas empleadas seguirán despertando el interés tanto de la comunidad científica como de los operadores económicos y gestores del riesgo, con el objetivo de trabajar conjuntamente para incrementar la seguridad y calidad de los alimentos. Durante los años 1980 y parte de los 1990, diversos enfoques de modelos cinéticos de crecimiento dominaron la escena de la Microbiología Predictiva, pero en la actualidad es evidente el regreso de los modelos de probabilidad de crecimiento, lo cual se puede atribuir a lo siguiente:
a) Reconocimiento de que la variabilidad de las respuestas en un tiempo estimado (tiempo de generación y duración de la fase de latencia) no presenta una distribución normal, pero comúnmente es descrita por una distribución Gaussiana inversa, en donde la varianza de la respuesta es directamente proporcional al cuadrado o al cubo del promedio de la respuesta al tiempo.
b) En el caso de patógenos potencialmente peligrosos (Escherichia coli O 157 :H7), en situaciones en las que el microorganismo se tiene en una dosis infectante baja, se requiere de su conocimiento para recomendar condiciones que eviten su multiplicación, por lo que la probabilidad de encontrar este tipo de microorganismos es más importante que el conocer su velocidad de crecimiento, máxima densidad de población o su tiempo de generación.
Los modelos predictivos se clasifican en función de su complejidad como primarios, secundarios y terciarios. A continuación, se presenta una breve descripción de estos tres tipos de modelos:
Modelos primarios: Los modelos primarios se ocupan de la descripción de los cambios del número microbiano (crecimiento, multiplicación, inactivación), en función del tiempo. Para la cuantificación de los microorganismos se pueden incluir Unidades Formadoras de Colonias (UFC), biomasa, medidas de absorbancia, o niveles de los metabolitos producidos. Muchos de los modelos primarios que se han desarrollado hasta ahora, son modelos que determinan la cantidad de población microbiana. En estos modelos, el desarrollo de un número total de células de una población es descrito por un sencillo conjunto de parámetros: máximo valor de crecimiento (A), velocidad de crecimiento (µm) y tiempo de latencia (A). La bibliografía sugiere que la suma del comportamiento de células de manera individual es igual al de la población, y esto es lo que lleva al desarrollo de enfoques más mecanísticos para la Microbiología Predictiva. Lo anterior conduce a las técnicas de modelación probabilística, en las que los parámetros del modelo están casualmente distribuidos dentro de la población total. Esto significa que los parámetros del modelo son parte de una distribución aleatoria, lo cual puede representar la variabilidad biológica entre las células individuales. Los modelos de probabilidad se toman más útiles cuando el tamaño del inóculo es pequeño y el tiempo de latencia individual es altamente variable dentro de esta pequeña población. Como ejemplos de modelos primarios se encuentran la ecuación de Gompertz, ecuación Baranyi y Roberts y el Modelo lineal en tres fases.
Modelos secundarios. Los modelos predictivos secundarios caracterizan los parámetros que aparecen en los modelos primarios, en función de las condiciones del medio, como la temperatura, pH, aw, etc., observándose la interacción entre dos o más factores sobre el crecimiento microbiano. Antiguamente, los modelos secundarios para el tiempo lag sólo se referían al efecto que presentaba la temperatura de incubación; sin embargo, en la actualidad han surgido modelos que incluyen otros factores relevantes como las condiciones de pre- enriquecimiento. Otros autores han desarrollado modelos secundarios independientemente del tiempo de generación y el tiempo de latencia, como por ejemplo enfoques polinomiales (Gibson et al., 1988; Buchanan y Philips, 1990; Zaika et al., 1998) y enfoques de redes neuronales artificiales de baja complejidad (Zwietering et al., 1994; Geeraerd et al., 1998; García- Gimeno et al., 2002). Entre otros ejemplos de los modelos secundarios están la ecuación de Arrhenius, los modelos de raíz cuadrada y el modelo de superficies respuesta (Buchanan y Klawitter, 1991 ).
Modelos terciarios: Los modelos terciarios tienen varias formas, empezando por combinar los dos primeros niveles de modelos (primario y secundario), basados en experimentos de laboratorio. Un ejemplo representativo de este tipo de modelos es el "Pathogen Modeling Program", creado y puesto a disposición de la comunidad científica gratuitamente por la USDA; dicho modelo permite importar una serie de datos de temperatura para predecir la vida útil. Otro ejemplo es el "Seafood Spoilage Predictor" (Dalgaard et al., 2002), el cual incluye a microorganismos deteriorativos específicos para alimentos del mar. Finalmente, los modelos terciarios permiten incluso incorporar modelos predictivos en una red de evaluación de riesgos microbiológicos, como por ejemplo el SERA ("Salmonella enteritidis Risk Assesment") del USDA. Los modelos terciarios son informáticos.
Construcción de los modelos predictivos
La construcción de un modelo predictivo implica las siguientes etapas: selección de cepas de microorganismos, generación de datos, aplicación de un modelo primario, secundario o terciario y validación del modelo aplicado. Las etapas iniciales de este proceso son de fundamental importancia para la correcta aplicación del mismo, por lo que se describen a continuación:
Selección de cepas de microorganismos. Existen varios criterios que se emplean para elegir la cepa a utilizar para la construcción de un modelo. Puede elegirse una cepa única o una mezcla de diferentes cepas (cocktail). Las mezclas de cepas están siendo empleadas ampliamente en los modelos predictivos, debido a que tienen una representación más real de la situación que presenta un alimento. Antes de elegir una cepa es muy importante poner en claro la intención a la que va dirigido el modelo, por ejemplo: ¿El modelo se va a utilizar para predecir el posible crecimiento de una especie de patógeno en particular, o es un modelo de una flora de microorganismos deteriorativos de un alimento específico?. El utilizar una cepa que ya haya sido estudiada en otros experimentos científicos o incluso con el propósito de crear otros modelos, proporciona la ventaja de tener conocimientos sobre esa cepa en particular. Por otro lado, la elección de una cepa aislada a partir de un alimento para el cual se quiere generar el modelo, da la ventaja del conocimiento del producto.
La hipótesis de que la variación entre cepas podría ser igual o menor que la variación estadística experimental, fue evaluada por Whiting y Golden (2002). Ellos estudiaron el crecimiento, supervivencia, inactivación y producción de toxinas de 17 cepas diferentes de E.coli, y observaron que las variaciones entre cepas fueron mayores que las incertidumbres relacionadas con el error experimental. Salter et al. (1998) compararon el crecimiento de E.coli M 23 no patógena con el crecimiento de varias especies de E.coli patógena, y sólo encontraron pequeñas diferencias en las respuestas de crecimiento entre las diferentes cepas. El modelo generado resulta de gran utilidad, ya que muchos investigadores no tienen acceso a instalaciones de laboratorio adecuadas para trabajar con cepas patógenas de E.coli, y el modelo que predice el comportamiento de E.coli M23 es capaz de describir el de cepas patógenas de E.coli, incluyendo E.coli 0157H:7.
Método de recuento de células viables. El método más utilizado para monitorizar el crecimiento de una población bacteriana es el recuento de células viables. Sin embargo, como se ha discutido anteriormente, el análisis microbiológico convencional presenta varias limitaciones, entre las cuales el tiempo requerido para la revitalización, enriquecimiento e incubación de las muestras es probablemente la más importante. Además, para la identificación de un microorganismo se requieren medios selectivos y pruebas bioquímicas, lo que puede demorar el resultado por días o incluso semanas. Debido a estas limitaciones, ha sido necesario recurrir al desarrollo de métodos rápidos que permitan disponer de los resultados en horas. Para la estimación exacta de los parámetros de una curva de crecimiento son importantes el número y la calidad de los recuentos hechos por expertos técnicos. Para facilitar el recuento del crecimiento microbiano se están desarrollando y estandarizando métodos alternativos como citometria de flujo, turbidimetria, impedanciometria, microscopía, entre otros. Al comparar con los recuentos viables, la turbidimetria y la impedanciometria son considerados métodos automáticos, los cuales permiten analizar un elevado número de experimentos, mientras que la citometria de flujo y la microscopía permiten obtener información adicional, como puede ser el estado fisiológico de las células (Rasch,
2004).
Método de citometría de flujo. La citometria de flujo permite la medición de diversas características físicas y químicas de células individuales en suspensión, proporcionando así una indicación de la heterogeneidad de una población de células eucariotas y procariotas en cuestión de minutos (Davey y Kell, 1996; Alvarez- Barrientos et al., 2000; Novo et al., 2000). Las células individuales confinadas dentro de un chorro de agua pasan rápidamente por una ventana de medición, en la cual varios parámetros de millones de células por segundo pueden ser medidos simultáneamente con alta precisión (Vives- Rego et al., 2000). La dispersión de la luz refleja el tamaño y la estructura celular, mientras que las mediciones de fluorescencia permiten determinar el contenido celular de cualquier constituyente que pueda ser marcado con un tinte fluorescente (Walber et al., 1997). De esta manera, la citometria de flujo combina la ventaja de ser una técnica de células individuales, con el poder de medir millares de células en corto tiempo. Los datos resultantes no sólo son un promedio de mediciones de células, sino también son una distribución de los parámetros medidos en las células. Con la citometria de flujo, la posibilidad de medición de una distribución de datos da una estimación de la heterogeneidad de la población microbiana y, de ese modo, también la posibilidad de detectar subpoblaciones que, por ejemplo, son resistentes a un tratamiento bajo ciertas condiciones de investigación.
El uso de la citometría de flujo en Microbiología Predictiva está limitado por los costos de los equipos; sin embargo, existen reportes de su uso. Tal es el caso de las investigaciones de Sorensen y Jacobsen (1997), quienes usaron citometría de flujo para enumerar las células viables de Debaryomyces hansenii en diferentes condiciones ambientales. Los datos de crecimiento fueron empleados para modelar el tiempo de latencia (A) y la máxima velocidad de crecimiento (µmax), en función de la temperatura, pH y concentración de NaCl.
Método de turbidimetría. La turbidimetria es un método empleado para estudiar el crecmnento bacteriano a través de mediciones de densidad óptica, lo que permite tener una secuencia del crecimiento microbiano en tiempo real. La densidad óptica o absorbancia se ha utilizado desde hace varios años para medir la concentración, y es expresada en masa, número o longitud media celular de suspensiones bacterianas. El fundamento de la técnica es que las partículas pequeñas difractan la luz, dentro de ciertos límites, de forma proporcional a su concentración. Las mediciones se hacen con un fotómetro o espectrofotómetro. De acuerdo con McMeekin et al. (1997), en la turbidimetria, el crecimiento microbiano está relacionado con la turbidez del medio. Estos autores resaltaron las limitaciones del método, siendo la más importante que un recuento viable sólo puede hacerse si el equipo está calibrado para relacionar la absorbancia con un número de microorganismos dado (Me Meekin et al.,1997). Sin embargo, es posible identificar los parámetros de crecimiento cuando el tamaño del inóculo está por debajo del umbral de detección. Para este caso es necesario conocer los recuentos celulares iniciales y la ecuación de calibración (Bréand et al., 1997).
Método TTD (tiempos de detección). Este método consiste en medir, después de un tratamiento térmico establecido, la probabilidad de no crecimiento de una población de microorganismos en suspensión en condiciones de cultivo determinadas. Se trata de un análisis que permite evaluar el número más probable de supervivientes (método indirecto). Este método depende de la temperatura y el tiempo de tratamiento para lograr un efecto fisiológico (Rasch, 2004).
Método de microscopía. La microscopía permite estudios directos de células individuales, lo que hace posible dar un seguimiento a la misma célula durante largos periodos de tiempo. La microscopía ha ido ganado interés con el desarrollo de programas computacionales como el de interferometría óptica y el análisis de imagen. Una de las ventajas de este método es que permite estudiar sistemas sólidos cuya situación es muy parecida a la que presentan los sistemas alimentarios (Rasch, 2004). Hay pocos reportes bibliográficos del uso de la microscopía en el modelado predictivo. Sin embargo, existen comparaciones con el método TTD (tiempos de detección) para la determinación de la fase de latencia de células de Listeria monocytogenes (Martínez et al., 2005). Se ha observado que la microscopía tiene ventajas sobre la TTD, ya que es un método directo que permite la observación visual de la primera división celular, mientras que la TTD depende del tiempo para la detección, la tasa de crecimiento y la extrapolación regresiva a la célula individual. Además, cualquier tratamiento que resulte en ausencia de la división celular no será detectable a través del método TTD (Wu et al., 2000).
Validación de los modelos
La validación de los modelos predictivos puede hacerse de dos formas:
a) Validación matemática que verifica la precisión de los modelos generados.
b) Validación en el alimento (sistema real), en la cual lo que se requiere es demostrar que el modelo predice con exactitud el comportamiento de los microorganismos durante el procesado, almacenamiento y distribución (Geeraerd et al., 2004).
Es importante validar un modelo para evaluar la habilidad predictiva del mismo (Geeraerd et al., 2004). La precisión de los modelos se evalúa gráficamente cuando se enfrentan los valores obtenidos en el laboratorio contra las correspondientes predicciones del modelo. Además, los valores del coeficiente de correlación (R2), el error cuadrado promedio y los factores de sesgo y de exactitud, se emplean como indicadores de la confianza de los modelos cuando se aplican en alimentos (Giffel y Zwietering, 1999). Sin embargo, es importante mencionar que aún cuando un modelo haya resultado adecuado para predecir los datos experimentales, la aplicación de modelos predictivos en alimentos todavía es cuestionable (Zhao et al., 2002).
Importancia de los modelos predictivos
Es interesante conocer cómo se emplean permanentemente los modelos predictivos en la investigación científica, industria e inclusive en la vida cotidiana. A continuación se mencionan algunas de las aplicaciones más importantes de los modelos predictivos:
Los modelos predictivos ayudan a tomar decisiones inmediatas en el reproceso de alimentos, por ejemplo, en eventos fuera de proceso tales como la falta de sal en el producto o una inadecuada refrigeración del alimento. Los modelos predictivos ayudan a predecir el grado crecimiento y/o sobrevivencia de algunos de los microorganismos de interés (patógenos o deteriorativos), bajo condiciones normales de almacenamiento, detectando de esta manera alguna falla en el proceso de almacenamiento. También ayudan a estimar las fechas de caducidad en términos de descomposición microbiana (Peleg, 2006). Los modelos predictivos permiten identificar los puntos críticos de control en un proceso en el que se ha implantado un programa de Análisis de Riesgo y Control de Puntos Críticos (ARCPC). Los modelos predictivos son herramientas educativas, especialmente para personas no preparadas en el área de Microbiología de Alimentos, porque a través de ellos se demuestra la importancia de mantener condiciones de almacenamiento apropiadas 01an Impe et al., 2005). El Modelo Matemático, es un análogo de una realidad física, por lo general más simple e idealizada, es decir, es una abstracción de la realidad.
Esto es, que a través de una serie de ecuaciones o modelos matemáticos se puede representar el entorno real, y predecir como se comportaran cada uno de los agentes que interactúan en ese entorno cuando cambia uno o varios factores que ejercen influencia sobre el objeto. Entonces, el objeto formal del modelo matemático es entender ampliamente el fenómeno y tal vez predecir su comportamiento en el futuro. La microbiología predictiva es la integración de los conocimientos tradicionales de microbiología con las que se encuentran en las disciplinas de matemáticas, estadística y sistemas de información y tecnologías para describir el comportamiento microbiano con el fin de evitar la descomposición de los alimentos, así como las enfermedades transmitidas por los alimentos , además , son una manera muy rápida, eficiente y rentable de la evaluación potencial para el crecimiento de microorganismos en condiciones específicas sin necesidad de estudios prácticos.
Modelos Basados en Individuos: Consideran cada microbio como individuo,una única y discreta entidad con más de una características de los cambios a través de su vida.
Modelos Cinéticos: Consideran las tasas de respuesta (crecimiento o muerte), como tiempo de demora ,tasa de crecimiento específico y la población máxima densidad o la inactivación.
Modelos Empíricos: Es una relación lineal, es la raíz cuadrada de la tasa de crecimiento promedio de un cultivo axénicos y la temperatura de cultivo , para una variedad de organismos creciendo en sus respectivos rangos de temperatura subóptimas.
La clasificación de los modelos, aun muestran una falta de claridad, ya que ningún plan tiene el pleno apoyo de la comunidad científica, sin embargo podemos elegir por adelantado la combinación más adecuada de condiciones de stress para llegar a la formulación de un producto estable y asi evitar la descomposición de mi alimento.
Conclusiones
El progreso de la Microbiología Predictiva en los últimos años ha sido muy importante, de tal suerte que la Microbiología Predictiva está siendo utilizada en una gran variedad de operaciones en el ámbito de la investigación y la industria. Los modelos predictivos son ahora una herramienta normal de investigación y una ayuda valiosa para evaluar y diseñar procesos de conservación de alimentos. Sin embargo, no es todavía posible depender solamente de los modelos para determinar la seguridad de los alimentos y su procesamiento. Las pruebas de laboratorio siguen siendo necesarias para determinar inequívocamente el crecimiento, supervivencia o muerte de los microorganismos inicialmente presentes en un alimento.
"SOMOS LO QUE HACEMOS REPETIDAMENTE. EXCELENCIA, POR LO TANTO, NO ES UN ACTO SINO UN HABITO"
ARISTOTELES
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